Проект «Создание платформы аптотераностики для диагностики и лечения глиом мозга человека»
Номер соглашения: 075-15-2020-809 (внутренний номер 13.1902.21.0030)
Сроки реализации: 2020 – 2022 гг.
Цель проекта: Создание целевых тераностических олигонуклеотидов к глиоме мозга человека, которые повышают эффективность терапии, качество диагностики и специфичность визуализации глиом.
Актуальность проводимых исследований для науки и практической деятельности:
Злокачественные образования считаются одной из самых серьезных проблем человечества. При этом часть опухолевых разрастаний все же поддается терапии, но есть злокачественные образования, в успешной терапии которых человечество пока не продвинулось. Одно из таких заболеваний – глиома. Глиому нельзя называть раком, так как она имеет нейроэктодерамальное происхождение. Однако это заболевание не становится от этого менее опасным. К сожалению, распространение этого заболевания возрастает последнее время. Отдельный вопрос, по какой причине это происходит, но перед человечеством встает вопрос о перспективах и новых подходах в терапии глиомы. Классификация глиомы обычно разделяет их, согласно их злокачественности, на четыре степени. Одна из самых агрессивных и злокачественных форм – глиома IV степени, которая получила также специализированное название – глиобластома. Средняя продолжительность жизни пациентов с таким диагнозом - около 12-15 месяцев. При этом все подходы в терапии глиобластомы не увеличивают значительно этот интервал и не влияют на продолжительность жизни и выживаемость пациентов. Это частично обусловлено тем, что поскольку глиобластома обладает высокой гетерогенностью, то многие подходы к терапии не могут охватить все типы опухолевых клеток глиобластомы и тем самым получается провоцирование гибели одних типов опухолевых клеток и выживание других. Выжившие клетки глиомы дают начало новой популяции и провоцируют рецидив. На данный момент стандартным подходом к терапии глиобластомы считается хирургическое удаление опухоли с последующей химиотерапией и лучевой терапией. При этом развитие лучевой терапии первоначально давало многообещающие результаты, так как ионизирующее излучение вызывает гибель опухолевых клеток. Однако наличие рецидивов после лучевой терапии заставляет обращать внимание на те опухолевые клетки, которые обладают радиорезистентностью (устойчивостью к лучевой терапии). В связи с тем, что все варианты терапии не позволяют достигнуть значительного увеличения продолжительности жизни пациентов, актуальна необходимость поиска новых подходов. Мы предложили создать платформу аптатераностики, на базе которой можно разрабатывать и новый класс препаратов с использованием аптамеров против роста опухоли, и диагностировать глиомы мозга по генетическим маркерам на основе специфических аптамеров, и усовершенствовать ПЭТ-диагностику с помощью использования радиоактивно-меченных аптамеров, узнающих опухолевые маркеры, и использовать аптамеры, как молекулы носители для противоопухолевых препаратов для повышения таргетной доставки к злокачественному образованию.
Превосходство полученного результата над зарубежными достижениями:
Аптамеры позиционируются, как синтетический олигонуклеотидный аналог антител, но меньшего размера, имеющие высокую специфичность к мишени и возможностью синтеза антидота. Платформа с использованием аптамеров может создать высокую конкуренцию иммунологической идеологии как в рамках диагностики, так и в рамках терапии. Кроме того, критически важно, что данная работа выполняется в тесном сотрудничестве медицинских специалистов, биологов и химиков. Подобные консорциумы в мире существуют, но их количество незначительно. Так, например, национальный консорциум существует в Германии, с базой в г. Гейдельберг. Именно там совместно с известной фармацевтической компанией Абботт и партнерами из Нидерландов проводятся работы по использованию антител для терапии глиом, но не аптамеров. Первые работы по аптамерам к EGFR – маркеру и фактору агрессии глиом, были начаты в лаборатории А. Элигтона с США, в Техасском университете. В Австралии есть консорциум, работа которого сфокусирована на опухолях мозга и терапии с использованием аптамеров. Национальный консорциум существует в Китае, в Гуаньджоу, где привлекается аптамерная тематика к решению онкологических задач. Аптамерная тематика для глиом развивается в Италии, в университете Неаполя.
Российский проект, благодаря уникальному тесному взаимодействию специалистов по химии, биологии, физике и медицине, показывает преимущества/превосходство в следующем. Химики изучают корреляции параметров «структура-свойства» аптамеров, что позволяет создавать аптамеры с более эффективными показателями, которые обеспечивают возможность трансляции молекул в медицину. Биологи создают уникальные в мире модели глиом человека для испытаний аптамеров и получают тканевые и клеточные препараты глиом из медицинского материала. Физики проводят исследования по флуоресцентной микроскопии взаимодействия аптамеров с клетками и тканями глиом, которые входят в топ-5. Медики обеспечивают постановку и, что критично, текущую корректировку задач для непосредственно трансляции в практические направления. Такой проект обеспечивает как уверенное позиционирование работ в топ-5 мировых исследований, так и по ряду перечисленных позиций превосходит зарубежные работы.
Полученные результаты в рамках соглашения подтверждены международными публикациями, что говорит об их оригинальности. Следует отметить, что коллектив представлен только отечественными специалистами, а, следовательно, отсутствует конфликт интересов. Таким образом, созданная платформа позволяет создать новый подход к терапии и диагностики глиом человека на основе использования аптамеров, что может составить значимую конкуренцию платформе с использованием антител.
Важность полученного результата для науки и социально-экономической сферы:
В настоящее время разрабатываются аптамеры, специфически блокирующие рецепторы факторов роста для опухолевых клеток. Более того, группа олигонуклеотидов, так называемые G-квадруплексные олигонуклеотиды, эффективно и специфически эндоцитируются опухолевыми клетками глиомы и ингибируют их пролиферацию, путем блокирования регуляторных белков. Кроме эксплуатации собственно антипролиферативной активности таких аптамеров, их можно использовать для доставки известных антипролиферативных агентов, обеспечивая синергичность действия такой бинарной комбинированной терапии. В рамках работ были обнаружены олигонуклеотиды, которые могут повышать радиосенсибилизацию опухоли к лучевой терапии. Кроме того, аптамеры можно химически модифицировать радиофармпрепаратами (РФП), такие конъюгаты позволяют более четко локализовать опухоль методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Дополнительными существенными преимуществом аптамеров являются их низкая токсичность, небольшой размер, который обеспечивает хорошую диффузию, роботизированный синтез. Данные исследования позволяют создать в России новый подход в области тераностики глиом человека с использованием аптамеров, что значимо как для науки, так и для социально-экономической сферы.
Конечный планируемый результат:
Организация платформы аптотераностики для диагностики и лечения глиом мозга человека. Данная платформа позволит создать класс технологий и фармпрепаратов, которые будут улучшать визуализацию глиомы при ПЭТ-диагностике, конструировать аптамеры, снижающие рост глиобластомы, и разработать аптамеры, снижающие инвазию глиомы после терапии (лучевого воздействия).
Проект состоит из 4 направлений: А – разработка терапевтических аптамеров, снижающих деление клеток глиомы; Б - разработка аптамеров, повышающих визуализацию глиомы при ПЭТ диагностике; В - разработка аптамеров, повышающих чувствительность глиомы к лучевой терапии и снижающих инвазию опухолевых клеток; Г - разработка аптамеров, способных доставлять терапевтический агент к опухоли.
Роль каждой организации-участника в достижении поставленных целей проекта:
НМИЦ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко координирует всю работу. На базе Центра получают из опухолевой ткани клеточные культуры, выполняется культивирование клеток глиомы человека с аптамерами, облучение клеточных культур, создание конъюгата аптамера с радиоактивным фтором. МГУ имени М.В.Ломоносова разрабатывает библиотеки аптамеров, оценивает их аффинность к мишени и другие химические характеристики аптамеров. ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова отвечает за синтез и очистку аптамеров, а также за создание промежуточных конъюгатов и модификации. ИВНД и НФ РАН проводит все исследования с использованием животных моделей с глиомой. Анализирует изменение миграционных и пролиферативных потенциалов клеток глиомы, проводит молекулярно-генетический и иммуноцитохимический анализ опухолевых клеток после воздействия аптамеров.
Аннотация:
Направление A. Разработка аптамера, снижающего пролиферацию опухолевых клеток глиомы человека и с минимальным влиянием на неопухолевые клетки.
Создана библиотека аптамеров, из которой выбраны наиболее перспективные аптамеры, способные снижать пролиферацию опухолевых клеток глиобластомы человека. Выбраны и исследованы аптамеры GR20, U31, U2, biG3T, которые показали антипролиферативные свойства на клеточных культурах, полученных из тканей глиомы пациента (III, IV Grade). Было показано, что данные олигонуклеотиды обладают не цитотоксическим эффектом, а цитостатическим. То есть данные аптамеры провоцировали гибель опухолевых клеток по пути программируемой клеточной гибели. При этом было показано, что U2, biG3T аптамеры не вызывали гибель в клетках нормы. Отсутствие их токсичности было доказано in vitro на линейных клетках фибробластов и на культурах фибробластов. Следовательно, наиболее привлекательными были признаны U2, biG3T, так как именно они существенно снижали деление опухолевых клеток, не влияя при этом на здоровые клетки. Аптамер U2 специфичен к мишени белок-рецептор EGFR. Для biG3T мишень была неизвестна, что требовало ее поиска. Для этого использовался метод масс-спектрометрии. В результате масс-спектрометрического анализа было обнаружено, что biG3T имеет высокую и безусловную специфичность к ядерному белку PARP1. Этот результат является крайне положительным, так как белок репарации ДНК поли(АДФ-рибоза) полимеразы 1 (PARP1) является достаточно перспективной мишенью для блокирования при онкологических образованиях. Ряд блокаторов PARP1 уже находятся на стадии клинических исследований. Так сейчас проходят многоцентровые клинические испытания два блокатора PARP1 рукапариб и олапариб. При этом известно, что подобные блокаторы рассматриваются как перспективные и при глиобластоме. PARP1 участвует в репарации ДНК и поддержании стабильности генома. PARP1 связывается с разрывами цепей ДНК и включает каскады клетки для восстановления повреждений ДНК. Показано, что при различных злокачественных образованиях: рак молочной железы, яичников, кожи, colorectum, легких и мозге повышается экспрессия мРНК и представленность белка PARP1. Интересно, что подобное повышение PARP1 характерно и для опухолей мозга. Например, PARP1 избыточно экспрессируется в глиобластоме, при астроцитомах высокой степени злокачественности, медуллобластоме и эпендимоме у детей. Было показано, что повышенная экспрессия PARP1 усиливает противостояние опухоли процессам апоптоза и приводит к ее устойчивости при любых вариантах терапии (химиотерапия, лучевая терапия). Разрабатываемые препараты на основе ингибиторов PARP1прикрепляются к каталитическому домену белка, и блокируют синтез полимеров АДФ-рибозы. В результате достигается снижение репаративного ответа клетки на повреждения ДНК, что приводит к включению каскада апоптоза. При этом показано, что использование ингибиторов PARP1 в комбинации с темозоломидом снижает химиорезистентность стволовых клеток. Эффективность ингибиторов PARP1 как противопухолевых препаратов была также доказана отдельно без использования известных химопрепаратов. Таким образом, biG3T может стать перспективной молекулой для разработки нового класса препаратов для терапии глиобластомы. Кроме того, проведена оценка апоптотического состояния клеток при действии лидер-аптамера biG3T и было показано повышение апоптоза в опухолевых клетках после его воздействия. Также оценена антипролиферативная способность лидер-аптамера на клеточных культурах глиом человека и показана концентрационная закономерность в подобном воздействии. Для клеточной культуры G01 (глиобластома человека, клеточная культура получена из опухолевой ткани пациента) оценено изменение транскриптома после воздействия biG3T и показано, что при анализе генной сети для культуры глиобластомы (GO1), подвергшейся воздействию biG3T, было выявлено существенное снижение экспрессии генов TP53, PARP1, CDC42, RHOA, RAC1.
Направление Б. Разработка аптамера, повышающего специфическое накопление радиофармпрепарата в опухоли для ее визуализации
Целью данного направления был поиск аптамеров, способных узнавать специфически клетки опухоли (глиобластомы). Данное направление важно для создания комбинированного синтеза радиоактивных трейсеров с аптамером для высокоточной и специализированной ПЭТ-диагностики. В ПЭТ-диагностики используется - фтордезоксиглюкоза — дезоксиглюкоза, меченая атомом фтора-18. Фтордезоксиглюкоза — дезоксиглюкоза, меченая атомом фтора-18, это неспецифический трейсер, она поглощается всеми клетками организма, так как по строению эта молекула близка к обычной глюкозе. После внутривенного введения фтордезоксиглюкоза повторяет начальный участок метаболического пути глюкозы, проникая из сосудистого русла в межклеточное пространство, а затем в клетки. Обычная глюкоза превращается в них в фосфат глюкозы, а трейсер — в [18F]-дезоксиглюкоза-6-фосфат, который не вступает далее в какие-либо метаболические реакции и остается в клетках тканей в течение всего времени исследования, что позволяет измерить в них концентрацию радионуклида фосфор-18. Опухолевые клетки потребляют значительно больше ресурсов и обладают гораздо большим количеством фермента гексокиназы (именно он фосфорилирует глюкозу, извлекая из нее энергию и превращая в вышеописанный фосфат). Таким образом, клетки опухоли и метастазов быстрее всех остальных накапливают трейсер, что позволяет их различить на фоне всех остальных с помощью позитронно-эмиссионной томографии. Диагностика с помощью 18F-фтордезоксиглюкозы (18F-ФДГ) позволяет выявить злокачественную опухоль размером от 4-5 мм, опухоли меньших размеров не позволяют выявить разрешающие способности современных ПЭТ/КТ-сканеров. Кроме того, четкое очертание краев опухоли до сих пор достигается не очень хорошо. Мы изучаем возможность использования аптамеров для более специфического связывания с опухолевыми клетками. Для разработки технологии и подхода используются ДНК-аптамеры к рецептору эпидермального фактора роста EGFR, специфичного для глиобластомы и стандартный метаболический трейсер для ПЭТ. В работе использовались высокоаффинные аптамеры GR20 и Gol1, способные повысить специфическое накопление радиофармпрепарата в опухоли с маркером EGFR. Исследуемые аптамеры могут образовывать стабильные вторичные структуры, демонстрируют наномолярные константы аффиности к EGFR-рецептору, обладают высокой специфичностью к опухолевым клеткам, и минимальной токсичностью к клеткам нормы. Изучена возможность повышения эффективности связывания ДНК-аптамеров с мишенью EGFR на клетках при получении нековалентных димеров ДНК-аптамера GR20. Показан различный характер взаимодействия аптамера и его димера с клетками глиобластомы G01. Димеризация не только не нарушает, но даже несколько стимулирует эффективность взаимодействия укороченного аптамера GR20 с клетками G01.
Для анализа эффективности попадания аптамеров в опухолевые клетки вместо радиоактивного фтора использовали конъюгацию с флуоресцентным красителем FAM. На клеточных культурах глиобластом показано, что локализация шпилечных ДНК-аптамеров к EGFR GR20 и Gol1 принципиально отличается от локализации GQ biG3T: аптамер Gol1 связывается с поверхностью клеток, после 3 часов инкубации начинает проникать в клетку и частично попадать в лизосомы; при взаимодействии клеток G01 с квадруплексом biG3T в течение 1,5 часов он локализован внутри клеток, предположительно в лизосомах. Это говорит о принципиально разном механизме взаимодействия рецепторных аптамеров GR20, Gol1 и квадруплекса biG3T с клеткой. Показано, что GR20 и Gol1 связываются с клетками опухоли и это связывание концентрационно зависимо от количества рецептора EGFR на поверхности клеток. В результате эксперимента визуализации флуоресценции конъюгатов аптамеров с флуоресцеином на модельных животных (крысы) с тканевой глиобластомой 101/8 получены данные о накоплении аптамера FAM-Gol1 (в количестве 100 нмоль на кг веса). Выбранный метод исследования и пробоподготовки позволяет эффективно визуализировать различные флуоресцентные препараты в разных дозах и может быть использован в дальнейшем для сравнительной оценки эффективности аптамеров в отношении глиобластомы крыс 101/8.
Для дальнейших исследований разработана методика получения радиохимического соединения (меченного 18F) для реакции мечения, выбранного лидер-аптамера.
Кроме того, в ходе исследований разработан новый метод детекции опухолевых клеток, с представленностью определенного маркерного-белка. Стандартные подходы к исследованию и молекулярному типированию опухолей в настоящее время включают в себя дорогостоящие малоспецифичные методы иммуноцитохимиии иммуногистохимии. В ходе наших исследований была продемонстрирована возможность применения искусственно созданных молекул нуклеиновых кислот, специфичных к белку-мишени (аптамеров), как альтернативы моноклональным антителам для цитохимии и гистохимии. Показано, что аптамер, специфичный к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR), избирательно окрашивает клетки глиобластомы человека и четко локализует EGFR-положительные клетки в гетерогенной опухоли. Данный результат говорит о возможности направленного создания аптамеров к различным белкам-мишеням. Предложенный метод можно использовать для оценки представленности белков-маркеров в клетках и срезах тканей как в научных исследованиях, так и при диагностике различных патологий (в т. ч. онкологии)
Направление Г. Разработка аптамера, обладающего высокой таргетностью к глиоме, антипролиферативной активностью и способного доставлять терапевтический агент к опухоли
Для разработки аптамеров, которые могут стать высокоспецифичными носителями терапевтически-эффективных молекул в зону опухоли использовали аптамер GR20. В конъюгате GR20-FAM FAM был заменен на доксирубицин. Доксирубицин использовался как классический препарат, вызывающий сильный токсический эффект в клетках как опухоли, так и нормы. Конъюгат аптамер – доксорубицин оценен на активность на клеточных культурах глиом человека, а также на клетках нормы: на клеточных культурах фибробластов человека и на глиальных клетках мыши. Показано, что токсичный эффект доксирубицина в конъюгате с GR20 вдвое снижается по сравнению с чистым доксирубицином в клетках глиомы. При этом обнаруживается, что конъюгат GR20-конъюгат оказался совершенно нетоксичным для нормальных неопухолевых клеток. Данный результат может быть очень перспективным, так как показывает специфичность подобного конъюгата только к клеткам опухоли.
Направление В. Разработка аптамера, повышающего радиосенсибилизацию опухоли при лучевой терапии
Была исследована возможность разработки аптамеров, повышающих радиосенсибилизацию клеток опухоли при лучевой терапии. Были получены клеточные культуры глиом человека высокой степени злокачественности (III и IV Gradde), клеточные культуры выводились из послеоперационного опухолевого материала пациентов. Клеточные культуры были разбиты на две группы. В одной группе, обозначенной как СС, были собраны клеточные культуры, которые были получены из опухолевого материала пациентов, ранее не проходивших лучевую терапию перед операцией. Во вторую группу, обозначенную как СС/Gy, были собраны клеточные культуры, которые были получены из опухолевого материала пациентов, проходивших лучевую терапию перед операцией. Клеточные культуры глиом человека были подвергнуты облучению 20Гр, при этом было обнаружено, что: в группе СС наблюдается широкое разнообразие ответного снижения пролиферативной активности клеток в интервале на 10- 60%, с одновременным существенным ростом маркеров стволовости Nestin, L1CAM, NOTCH1,2, NANOG, OCT4. При этом наблюдается рост миграционных свойств выживших опухолевых клеток и возрастание экспрессии маркеров миграции TIMP3, FN1, NOTCH3, CXCR3, CD44, EGFRVIII. В группе СС\Gy снижение пролиферативной активности более однообразно около 40%, рост маркеров стволовости менее интенсивный, наблюдается незначительное повышение L1CAM, NOTCH1,2. При этом клетки не изменяют своих миграционных свойств (или незначительно). Таким образом, мы обнаружили, что после первичного облучения остаются опухолевые клетки, обладающие высокими миграционными способностями, что дает начало отсроченному рецидиву.
При облучении этих групп клеточных культур глиом человека 20Гр и последующим воздействием biG3T обнаружено, что: в группе СС существенно снижается пролиферация и это снижение становится более однообразным, снижаются маркеры стволовости, наблюдается рост процента гибели не по некротическому пути, а по апототическому. При этом снижается миграционная способность опухолевых клеток. Использование аптамера значительно повышает радиочувствительность клеток опухоли, что может быть перспективно для использования в терапии. При этом аптамер снижает способность опухолевых клеток к миграции, что также может быть привлекательно для защиты пациентов от рецидивов. В клеточных культурах CC/Gy, полученных из опухолей, подвергавшихся ранее облучению, после повторного облучения и воздействия аптмера наблюдается снижение пролиферативной активности клеток, но в данном случае этом эффект меньше, снижаются маркеры стволости, наблюдается рост апопотоза. Миграция опухолевых клеток снижается, но менее значительно.
Таким образом, использование комбинированной терапии с применением лучевого терапии и последующего введения аптамера может дать возможность существенно снизить процент выживания опухолевых клеток, и самое важное снизить их способность мигрировать в здоровую ткань мозга.